INSTITUTO
TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
Que
Presenta
LUZ EUGENIA RUIZ NAJERA
Número
de contro
08930132
Carrera
Lic
biología
Ciudad
Altamirano, Gro. 14México. Marzo
del 2012
INTRODUCCION
objetivo genera
conocer y interpretarla la replicacion del adn procarionta y eucarionta
objetivo espesifico
identificar la diferencias entre replicacion procarionta y eucarionta
metodologia
para realizar este terabajo se realizo investigacion documental se realizo una investigacion algunas paginas de interne
UNIDAD
4 REPLICACIÓN DEL ADN
REPLICACION DEL ADN
UNICA
MANERA REPLICACION
REPLICACION
SEMI CONCERVATIVO
COPIAS DEADN REPLICACIOPOR PARTES
La propiedad más notable de las células vivas es su
capacidad de reproducirse con una fidelidad casi perfecta, no solamente una
generación, sino durante centenares y millares de generaciones. El modelo que
explica cómo se duplica el DNA se denomina modelo semiconservativo ya que a partir
de una molécula de ADN obtendremos dos exactamente iguales, cada una con una
hebra antigua (cadena parda en la imagen siguiente) y otra nueva (cadena
naranja en la imagen siguiente): la cadena original comienza a separarse de un
extremo a otro de modo que cada una de las hélices va a sintetizar una hélice
nueva complementaria habiendo tomado como modelo o patrón a la hélice inicial.
La replicación del DNA está catalizada por
una enzima que se denomina DNA-polimerasa: cataliza la formación de
cadenas de nucleótidos por la adición sucesiva de nucleótidos trifosfato (NTP).
Al incorporarse el NTP, se liberan dos de los tres fosfatos para aportar la
energía necesaria a la reacción química.
. Las DNA-polimerasas sólo funcionan
utilizando un DNA como molde, necesitando inexcusablemente un cebador (pequeño oligonucleótido
de 5 a 30
nucleótidos
que puede ser un pequeño DNA o RNA) al que se
añadirá el primer nucleótido. Los nucleótidos se van añadiendo en el extremo 3’ de la cadena en síntesis
Todas las DNA-polimerasas tienen una
estructura común en forma de mano derecha con tres dominios claramente
diferenciados a lo que denominaremos «dedos», «palma» y «pulgar».
La DNA-polimerasa no comienza a replicar ni
al azar ni en cualquier parte. Un complejo sistema de regulación intracelular
le indica el momento del ciclo celular en que debe comenzarse la replicación,
la enzima reconoce una secuencia de nucleótidos llamada origen de
replicación que marca el punto el que ha de comenzarse la replicación. En Escherichia coli es la
secuencia de 245 pares de bases que tiene varias repeticiones de una secuencia
consenso GATCTNTTNTTT.
NOTA Meselson y Stahl confirman en 1958 que la síntesis del DNA es semiconservativa partiendo de un DNA con gran contenido de [15N].
El
proceso se inicia con la enzima helicasa
que se dedica a deshacer los puentes de hidrógeno entre los pares de bases para
poder separar las dos cadenas del DNA.
En el caso de E.
coli, se observa que el origen de replicación es rico en A y T para
que cueste menos energía separar las cadenas. La separación de las dos cadenas
provoca una serie de tensiones topológicas en el DNA que hacen necesaria la
intervención de otras enzimas, las topoisomerasas,
para eliminar dichas tensiones.Se forma así una burbuja de replicación
con un ADN desapareado flanquedado por sendos ADN apareados
interviene una
DNA-polimerasa denominada primasa
que sintetiza un corto fragmento de RNA de 10 nucleótidos que actúa de cebador.
El cebador es elongado por la DNA-polimerasa en dirección 5´->3´. interviene
una DNA-polimerasa denominada primasa
que sintetiza un corto fragmento de RNA de 10 nucleótidos que actúa de cebador.
El cebador es elongado por la DNA-polimerasa en dirección 5´->3´. Una de las
dos hebras, la hebra conductora es de crecimiento continuo puesto que la
horquilla se va abriendo en el mismo sentido que la DNA-polimerasa añade los
nucleótidos. La otra cadena (hebra retrasada) transcurre en sentido
opuesto, por lo que ha de seguir un proceso un poco diferente para replicarse.
En ella la primasa sintetiza el cebador a 1000 nucleótidos del punto de
separación del DNA progenitor. A partir del cebador la DNA-polimerasa sintetiza
unos 1000 nucleótidos de DNA, alejándose de la horquilla de replicación,
formándose el denominado fragmento
de Okazaki. Después, otra DNA-polimerasa distinta retira los
fragmentos de RNA que han hecho de cebador y rellena los huecos con nucleótidos
de DNA. Finalmente la ADN-ligasa
empalma entre sí los diferentes fragmentos para formar una cadena única a
partir de los fragmentos de Okazaki; por eso se dice que es una replicación
discontinua. El proceso continúa hasta que se duplica todo el DNA. El conjunto
de proteínas que se forman el punto de bifurcación de la horquilla se conoce
como replisoma
La biosíntesis de la hebra guía y rezagada
esta coordinada, por que la hebra rezagada forma un bucle de manera que físicamente apunta en la misma dirección que la hebra guía
La replicación del
DNA circular produce las llamadas estructura en q que se forma como
resultado de las dos horquillas de replicación Para exponer las hebras sencillas
de DNA, las dos hebras progenitoras deben girar. Por cada 10 bases que se
copian el DNA debe dar 1 vuelta completa
El desenrollamiento
del DNA induce a un super-enrollamiento negativo (en la dirección opuesta). La
replicación semiconservativa del DNA requiere que se produzca un corte en uno o
en ambos nucleótidos del esqueleto para aliviar la tensión en la molécula, esta
labor la hace las topoisomerasas. La
topoisomerasa I cambia el DNA superenrrollado a un DNA relajado, La
topoisomerasa II (girasas) produce hélices negativas al destorcer el DNA
4.1
Replicación del genoma procariótico
en el único cromosoma, mientras que en los de
eucariotas suele haber muchos más (a veces más de 30.000) por cada cromosoma.
- DNA polimerasas
procariotas
Las DNA polimerasas
I, II y III se encuentran en las procariontes
LA DNA
polimerasa III de E.
coli esta formada por 7 subunidades: a, b, g, d, e, q y t. Las siete son escenciales para la
actividad máxima.
La DNA pol. III es la principal enzima de
replicación en E. coli. La DNA pol. I es responsable de la reparación de
DNA dañado. La funcion de la DNA pol II no esta todavía clara.
LA DNA
polimerasa III de E.
coli esta formada por 7 subunidades: a, b, g, d, e, q y t. Las siete son escenciales para la
actividad máxima.
La DNA pol. III es la principal enzima de
replicación en E. coli. La DNA pol. I es responsable de la reparación de
DNA dañado. La funcion de la DNA pol II no esta todavía clara.
Se conocen cinco
polimerasas eucariontes (a, b, g, d y e.) y tienen un mecanismo de acción
similar al de las enzimas procariotes.
Las DNA pol. a y d son las que están asociadas mas directamente
ala replicación del DNA cromosómico.
La DNA pol. b es responsable de la reparación del
DNA. L DNA pol. g se encuentra en las mitocondrias y se encarga
de replicar el DNA mitocondrial. La DNA pol. e es recién descubierta y se asemeja
en funciones a d.
Los
retrovirus contienen RNA y no DNA como material genético, y tienen una DNA
polimerasa dependiente del RNA (una trascriptasa inversa
4.2. Replicación del DNA en eucariontes.
Las principales
complicaciones adicionales son que el DNA en eucariontes se organiza en
varios cromosomas lineales y que el
DNA es mucho más largo El movimiento de
la DNA polimerasa es mucho más lento que en los procariontes; para
compensar esto, una célula eucarionte tiene mas o menos 20 000 moléculas de la
enzima. Esto permite que se forme un numero mayor de horquillas de replicación,
por ejemplo 2000 o más, en los cromosomas eucariontes. También se forman
fragmentos de okazaki más pequeños, con longitud de 40 a 300 bases
Terminación
de la replicación: síntesis de los telómeros
El final de la
replicación en eucariotas tiene que resolver el problema del acortamiento de
los cromosomas. Para ello ha desarrollado la estructura de los telómeros y
telosomas, y la actuación de una nueva enzima emparentada con las
retrotranscriptasas: la telomerasa.
4.3.
Control de la replicación
El proceso
resultante de la duplicación de ADN se conoce como división celular, la cual se
ha estudiado a nivel citológico estableciéndose ciertas pautas cubiertas por lo
que se conoce como ciclo celular. La mayor parte de los estudios de ciclo
celular se han llevado a cabo empleando S. cerevisiae,
En el caso de este organismo hay que añadir la ventaja de que actualmente se
conocen los aproximadamente 16 millones de pares de nucleótidos que constituyen
la secuencia completa de su genoma
Los fundamentos de
nuestro conocimiento actual del ciclo celular en levaduras vienen de la
búsqueda sistemática de mutaciones en genes que codifican para componentes de
la maquinaria del ciclo.
Estas quinasas son
las subunidades catalíticas de un complejo que incluye también na subunidad
reguladora, denominada ciclina, necesaria para la función del complejo
al determinar la localización o la especificidad de sustrato de la quinasa.
.4
Replicación in vitro del ADN (PCR)
Fundamentos
de la reacción en cadena de la polimerasa
La Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite la copia in
vitro de secuencias específicas de DNA la PCR es una técnica sencilla,
consiste en la separación por calor de las dos cadenas del DNA que se quiere
amplificar, y su copia simultánea a partir de un punto, determinado por un
fragmento de DNA artificial llamado cebador, mediante la acción de una enzima
denominada DNA polimerasa
La gran ventaja de la PCR es que
amplifica únicamente el fragmento de DNA que queremos aunque esté en cantidades
mínimas (alta sensibilidad) o en presencia de grandes cantidades de
otros DNA semejantes (alta especificidad). La reacción es eficaz incluso
si se parte de muestras de DNA muy poco purificadas, en presencia de otros
componentes
4.4.1
Secuenciación del ADN
Existen TRES métodos de secuenciación de los
ácidos nucleicos. Uno de ellos (Maxam y Gilbert) utiliza reactivos químicos a
fin de cortar el DNA a nivel de bases específicas. El otro se denomina enzimático,
de terminación en cadena o didesoxi (Sanger, Nicklen y Coulson). Y actualmente
el métodos automatizado con lectores
laser de capilaridad. El fin de ambos es conseguir la secuencia completa de
cada una de las bases que constituyen un fragmento de ácido nucleico. . El tratamiento posterior con piperidina
producirá la rotura de la cadena allí donde la base había sido alterada.
Especificidad
Base Reactivo
G Dimetil
sulfoxido
G+A Acido
fórmico
T Permanganato
Potásico
C Hidroxilamina
Posteriormente se analizan los fragmentos en geles desnaturalizantes.
Actualmente para el
marcaje se utilizan cuatro fluorocromos distintos: fluoresceina,
NBD(4-cloro-7nitrobenceno-2oxal-diazol), tetrametilrodamina y rojo texas, uno
para cada base.
Método
enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger
El ADN molde o segmento de
ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN,
previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay
que clonarlo en un vector apropiado. Además, debe estar en estado de hélice
sencilla.
Un enzima que replique el ADN, normalmente la
ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea
como molde ADN de hélice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de
las bases nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador o
"primer".
Un cebador o "primer" que suele ser
un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para
que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH.
Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del
fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de
nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un
"primer" con secuencia complementaria al vector empleado para
clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del
vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema cuya secuencia
se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.
Los cuatro nucleótidos
trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente
el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucleótidos trifosfato
en cada reacción.
se necesitan
nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos didesoxi
son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición
3' de la desoxirribosa
Breve
descripción del método enzimático de terminación de cadena
deben realizarse en cuatro tubos
diferentes, cuatro mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción contiene los
cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I,
un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido didesoxi, por ejemplo ddATP,
a una concentración baja. El nucleótido didesoxi utilizado (ddATP en este
ejemplo) competirá con su homólogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN
que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el
momento y lugar donde se incorpora. en cada mezcla de reacción se producen una
serie de moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud que terminan
todas en el mismo nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5'
(todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado)
Los fragmentos de
ADN de nueva síntesis obtenidos en cada mezcla de reacción se separan por
tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida que permiten
distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucleótido.Los
productos de cada una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro
carriles diferentes del gel.
Teniendo en cuenta
que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5' ® 3', si comenzamos a
leer el gel por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5') y avanzamos
aumentando el tamaño de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del
ADN de nueva síntesis en la dirección 5' -- 3'.
Breve descripción del método
automático de secuenciación
La principal diferencia entre
método enzimático de terminación de cadena y el método automático de
secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el método
automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es
realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido trifosfato (dTTP)
marcado con un fluorocromo distinto.
La segunda diferencia radica en el
sistema de detección de los fragmentos de ADN. La detección del tipo de
fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo
que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que
ya han sido detectados se dejan escapar del gel,
El siguiente esquema representa
de forma abreviada el método automático de secuenciación
BIBLIOGRAFÍA
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2.-
.Brown,C.M; I. Campbell y F.G. Priest 1989. Introducción a
la Biotecnología.
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4.- De Robertos y Robertis, F. K. 1987.
Biología celular y molecular.
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6 - Glick y
Pasternak. 1998..Molecular biotecnology.
7 - Griffiths et al. 1997. Genetica.
McGraw-Hill/Interamericana. España.
8 - Griffiths et al. 1999. Genetica moderna.
McGraw-Hill/Interamericana. España.
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1998. Biologia molecular y biotenología. Addison-Wesley
Iberoamericana
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