UNIDAD 10 TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

                            INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

                                                    

                                                                     Que Presenta

                             UNIDAD 10 TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

                                                                                

                                                               Nombre del Alumno

                                                             luz eugenia ruiz najera

                                                              

                                                          

                                                             Número de Control     

                                                                  08930132 

                                                            

                                                           Carrera Lic biología

                                                                         

                                                          

                                     Ciudad Altamirano, Gro.México. 3de junio del 2012   

                                                           

                           UNIDAD 10 TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

                                                                    INTRODUCCIÓN

 La reacción en cadena de la polimerasa, ya más conocida como PCR, es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Uno de los aportes fundamentales de esta metodología a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas ¡ornadas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción -una gran cantidad de un fragmento génico con alto grado de pureza- favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna. Entre las aplicaciones médicas de la PCR cabe destacar su aporte al desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres seropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos impide obtener resultados confiables, con los métodos convencionales, durante el primer año de vida. También ha facilitado el diagnóstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, e hizo posible reconocer mutaciones de ganes vinculadas con enfermedades oncológ icas. Su sensibilidad permite detectar poblaciones residuales de células cancerosas en pacientes sometidos a quimioterapia y de este modo se ha podido determinar, con una antelación en extremo valiosa, un nuevo avance de la enfermedad. Existen ya modos de evaluar a través de la PCR el riesgo de padecer dolencias tales como diabetes de tipo I y la enfermedad celíaca. Precisamente los autores del presente trabajo y colaboradores han obtenido, mediante el empleo de esta técnica, resultados que indican la existencia de una vinculación entre determinadas variantes genéticas y dichas enfermedades en la población argentina.

Los genes son porciones de ácido desoxirribonucleico (ADN) que tienen la información necesaria para la fabricación de los ácidos ribonucleicos (ARN) y, en última instancia, a través de éstos, de las proteínas: el ARN "copia" el mensaje contenido en el ADN y a partir de él da lugar a la correcta formación de la cadena o secuencia de aminoácidos que constituyen las proteínas.

Todos los genes están compuestos por la misma materia prima: una sucesión de nucleótidos. Cada nucleótido está formado por un grupo fosfato, un azúcar con cinco carbonos (la desoxirribosa) y una de las siguientes bases nitrogenadas: adenina, timina, guanina o citosina. Los genes no se distinguen unos de otros por tener una composición fisicoquímica muy diferente, sino por el orden o secuencia en la que estas cuatro bases se disponen a lo largo de la molécula de ADN (véase "Somera descripción del ADN. El hecho de que los genes no se distingan por su composición fisicoquímica hace prácticamente imposible aislarlos mediante el empleo de métodos bioquímicos de fraccionamiento del tipo de los usados para purificar proteínas como son, por ejemplo, la cromatografía, la electroforesis o la ultracentrifugación.

Por otra parte, cada gen es una unidad de información sin solución de continuidad respecto del resto del ADN en el que está inmerso. Esto significa que a todo gen lo preceden y suceden otras secuencias de ADN que, en general, no tienen relación con él. El gen que codifica para la insulina, por ejemplo, tiene una "longitud" de 1.700 bases y su masa representa sólo la dos millonésima parte del ADN contenido en el núcleo de una célular

Objetivo general

Conocer las diferentes técnicas de la biología molecular

Objetivo específicos

Conocer  el funcionamiento de las diferentes técnicas de la biología molecular

Metodología

Este trabajo  se realizo por medio de una investigación  documental  en diferentes fuentes   informativas

UNIDAD 10 TÉCNICAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

10.1 Métodos de purificación y análisis de los ácidos nucleicos.

              

                    OBTENCIÓN DE ADN Y SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN.

A un laboratorio de Biología Molecular llegan  distintos tipos de muestras, cada una con sus peculiaridades a la hora de analizar y obtener su ADN. “A priori” se plantean dos situaciones diferentes. Si lo que se pretende es conocer la ubicación física del ADN/ARN de interés en un  corte histológico se deberá  proceder a estudios “in situ”, mientras que si no es necesario conocer dicha ubicación será suficiente con obtener el ADN celular en solución.

Una vez realizada la lisis, la solución de ADN obtenida no siempre es apta para utilizar en las reacciones posteriores de amplificación, restricción, marcaje o secuenciación, por lo que es conveniente por un lado separar el ADN del resto de macromoléculas que lo acompañan, preferentemente proteínas, proceso que suele realizarse con ayuda de solventes  orgánicos (fenol y cloroformo) y, por otro separar el ADN de aquellas moléculas de pequeño tamaño con actividad inhibidora presentes en la solución de ADN

En ciertos casos la simple detección del fragmento amplificado tiene valor diagnóstico por sí mismo. La metodología empleada para la detección puede ser:

1.      separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o poliacrilamida (Ej. detección de infección por virus de la hepatitis, SIDA, HPV oncogénicos...). En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de características conocidas (Ej. movilidad de un exon mutado del gen supresor p53 en relación al mismo exon normal...), o bien,

2.      detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado colorimétrico o quimioluminiscente.

Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:

 

1.      Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la restricción se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación HPV, genotipado ApoE...).

2.      Hibridación.  Los fragmentos generados en el PCR se separan en  gel de agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcado (Ej. Tipificación de los genes HLA Clase II...).

3.      Secuenciación.  Los fragmentos generados durante la reacción de secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej. Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas enfermedades...). 

10.2 Técnicas de hibridación

                                            

                                           la hibridación de acidos nucleicos

Es un proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana

Formato de hibridación

                                         TECNICAS DE HIBR IDACION

Hibridación in situ con filtro (HISF). Este método tampoco precisa de extracción de ADN y analiza muestras obtenidas por raspado o con torunda o cepillo. Las células se aplican directamente sobre un filtro el cual se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la desnaturalización del ADN.

  Hibridación Southern blot (SB). Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio.

El blot invertido (BI) es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con con diferentes DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una reacción individual para cada especímen, de sensibilidad inferior al SB

El dot/spot blot (DB) consiste en la extracción del ADN celular total y en su desnaturalización, después se fija a una membrana por medio de presión negativa en un aparato manifold. También se puede realizar la desnaturalización en la misma membrana. Una vez realizada la hibridación se produce la autorradigrafía, si se emplearon sondas calientes o el revelado enzimático, si se utilizaron frías. Con el DB se pueden analizar de una vez mas de 100 especímenes mientras que el SB no admite mas de 15

  La hibridación sandwich (HS) no necesita extracción del ADN. Esta técnica utiliza una sonda con dos fragmentos separados, cada uno con una región complementaria con el ácido nucléico diana. Un fragmento se une al filtro y fija la secuencia específica de HPV al mismo. El segundo de los fragmentos está marcado y se fija al híbrido anclado en la membrana permitiendo su detección

La hibridación Northern se utiliza para la detcción de RNA  de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN

                          Detalle de la tecnica de Southern

Esta técnica fue descrita por el Dr. Southern en 1975 y constituye el método más utilizado para analizar la estructura del ADN cortado por enzimas de restricción. Para la realización de esta técnica se debe extraer ADN genómico de linfocitos de sangre periférica para conocer el genotipo normal del individuo y ADN del tejido tumoral

Después de dicha digestión, el aproximadamente millón de fragmentos de ADN obtenidos, se separan entre sí, según su tamaño , en un gel de agarosa, sometido a un campo de corriente continua en una cubeta de electroforesis

Figura 2.13. Representación esquemática de la técnica de Southern Blotting para el estudio de las secuencias específicas en el ADN genómico.

La técnica de Southern Blotting permite identificar uno o dos fragmentos de ADN de interés en el aparentemente uniforme colección de millón de fragmentos cortados con la enzima de restricción. El siguiente paso consiste en la desnaturalización de los fragmentos de cadena doble para obtener fragmentos de cadena única. Esto se logra con un bufer de Ph básico.

La molécula de cadena única es transferida desde el gel a una membrana de nilón o a papel de nitrocelulosa, ayudado por capilaridad.

La identificación de uno o más fragmentos de interés se logra con una sonda específica marcada con radioactividad o colorimetría.

                                             Figura . Técnica de Southern Blotting

10.3 Técnicas de clonación de genes.

Consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos a partir de uno original. Para ello se aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc..) que tras introducirlo dentro de una célula va a permitir su replicación por cultivo.

 10.4 Prueba de PCR en el diagnostico de enfermedades Genéticas Por microorganismos (bacterianas, protozoarios, entre otros)

Las aplicaciones actuales de la biología molecular para el diagnóstico clínico son muy variadas:

Genética

• Diagnóstico prenatal
• Tipaje de HLA
• Reordenamientos genéticos
• Detección de esperma aneuploide
• Creación de mapas genéticos

 

Diagnóstico Microbiológico

·        Diagnóstico rápido de infecciones víricas

·        Detección de microorganismos en células infectadas/transformadas

·        Determinación de la relación génetica entre varios tipos de microorganismos similares

·        Correlacionar la presencia/expresión de agentes virales/infecciosos en tejidos

         neoplásicos.

·        Determinar la resistencia a los antibióticos de las bacterias.

·        Epidemiología de las infecciones

·        Detectar y cuantificar microorganismos difíciles de cultivar o para los que no existen

           reactivos serológicos.

·        Detectar regiones transformantes específicas en virus

 

 

Diagnóstico y clasificación de neoplasias y establecimiento de un pronóstico

·       Detectar reordenamientos de genes

·       Detectar reordenamientos en tumores humanos con anomalías consistentes cario típicas

·       Detectar reordenamientos moleculares/anomalías de expresión genética en ausencia de alteraciones del cariotipo  

·        Estudio de la estructura/expresión de oncogenes

·        Detección de amplificación genética/resistencia a drogas

·        Diagnóstico de cell lineage en base a la expresión genética 

APLICACIONES PCR

La extraordinaria sensibilidad de la técnica de PCR, que permite detectar una copia viral en un millón de células es un arma de gran valor en la detección de infecciones HPV, especialmente en aquellas con un bajo número de copias víricas, como es el caso de la infección oculta. El problema mas importante de las técnicas de amplificación genómica es la contaminación de la reacción con ADNs extraños, en cualquiera de sus fases, produciendo resultados falsamente positivos

                               10.5 Tecnología del ADN Recombinante

                                                       Introducción

La tecnología del DNA recombínate es una técnica que ha permitido introducir material genético foráneo en un individuo, y hacer que éste organismo incorpore dicho material a su genoma y lo exprese como si fuera suyo. Esta tecnología desarrolló a partir del descubrimiento de las enzimas de y su acción sobre los ácidos nucleicos. Cuando se complementó el estudio de las enzimas de restricción con la micromanipulación

El principio de la tecnología de DNA recombínate se basa en la inserción de un fragmento de DNA foráneo en un hospedero de clonaje molecular  por medio de un vector de clonaje, como ser un virus o un plásmido.

En la actualidad existe una gran cantidad de aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante a todo nivel. Se aplica esta técnica para la producción de vacunas, para la producción de proteínas, aminoácidos, vitaminas y ribonucleótidos y la producción de curas genéticas para algunas enfermedades, en el campo médico.

Otra aplicación de la tecnología de DNA recombinante bastante reciente, es la producción de microorganismos transgénicos para procesos de bioremediación de hidrocarburos, metales pesados como el mercurio.

           

  PRINCIPIOS DE LA TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE

Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos.

         Tabla. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffiths et al. 1998).

Enzima de restricción	Organismo de donde se extrae
EcoRI	Escherichia coli
EcoRII	Escherichia coli
HindII	Haemophilus influenzae
HindII	Haemophilus influenzae
HaeIII	Haemophilus aegyptius
HpaII	Haemophilus parainfluenzae
PstI	Providencia stuartii
Mayi	Serratia marcesens
BamI	Bacillus amyloliquefaciens
BglII	Bacillus globiggi

 Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte:

(1) corte con extremos cohesivos y

(2) corte con extremos romos (ver Fig. ) (Griffiths et al. 1998).

Fig.  Producción de extremos (a) cohesivos y (b) romos, por medio de enzimas de restricción en hebras de DNA.

MÉTODO

v    Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras.
Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.
Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.

v  Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación. 

v  VECTORES Y HOSPEDADORES

Los vectores son unidades de ADN que se autoreplican en un microorganismo o células humanas y los cuales pueden portar fragmentos de ADN de origen diverso. El vector debe contar con los elementos que le permitan ser replicados y mantenidos por la maquinaria celular hospedadora.

los vectores tienen diferente capacidad de portar longitudes variables de secuencias de ADN. Los cromosomas artificiales mamíferos se vislumbran como vectores de terapia genética de condiciones causada por genes mayores como el de la distrofina, cuya disfunción causa la distrofia muscular de Duchenne-Becker, gen que tiene una longitud de secuencia de 2.4 Mb (7).

TIPOS de VECTORES y HOSPEDADORES
VECTOR		HOSPEDADOR	ESTRUCTURA		CAPACIDAD kb
Plásmidos Bacteriófagos Cósmidos BACs YACs MACs		E.coli E.coli E.coli E.coli Levadura Células mamíferas	Plásmidos Circulares Plásmidos Circulares Plásmidos Circulares Plásmidos Circulares Cromosomas lineales Cromosomas lineales		5-10 5-10 35-45 hasta 300 100-2000 >1000
	Figura b

En la figura b, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido.
En la figura a tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)

La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

Métodos de introducción del vector. 

El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto

Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.
La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma.

-Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.
En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar

Selección de células recombinantes

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.

Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.

Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota. 

 

BIBLIOGRAFÍA

1.-. Avers, Ch. 1987. Biología Celular.

2.- .Brown,C.M; I. Campbell y F.G. Priest 1989. Introducción a la Biotecnología.

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4.- De Robertos y Robertis, F. K. 1987. Biología celular y molecular.

5.- Gardner, E. J. 1979. Principios de genética.

6 - Glick y Pasternak. 1998..Molecular biotecnology.

7 - Griffiths et al. 1997. Genetica. McGraw-Hill/Interamericana. España.

8 - Griffiths et al. 1999. Genetica moderna. McGraw-Hill/Interamericana. España.

9.- . Karp, G. 1992. Biología celular

10.- . Levine, R. 1981. Genética. Compañía.

11.- Scriban, R. 1992. Biotecnología.

12 - Smith y Wood. 1998. Biologia molecular y biotenología. Addison-Wesley 

       Iberoamericana

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18.- Wiseman, A. 1986. Principios de Biotecnología.

19.- Waller, J.M y E.B. Gingold. 1988: Biología Molecular y Biotecnología.

20.- Wallace, R.A: Jack,L. King y Gerald P. Sanders. 1991 Biología Molecular y Herencia.